摘要
目的：研究蜂*注射液(FD)对前列腺癌细胞凋亡的影响及可能机制。方法实验设立空白对照组和蜂*注射液不同浓度组，用MTT方法检测前列腺癌细胞活性，AnnexinV/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡，同时用流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度。结果与对照组比较，作用24小时、48小时、72小时后，FD8μg/ml，12μg/ml，16μg/ml，20μg/ml，24μg/ml组活性降低，8μg/ml作用24小时后细胞凋亡增多(P＜0.05)，4μg/ml，8μg/ml作用24小时，细胞内Ca2+浓度增高。结论蜂*注射液可以诱导前列腺细胞凋亡，其作用可能与细胞内Ca2+超载相关。关键词
蜂*注射液；前列腺癌细胞；细胞凋亡前列腺癌是世界范围内发病率排名第二的男性恶性肿瘤［1］，确诊时多为晚期，内分泌治疗后几乎都会发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)，中位生存期短。如何延缓晚期前列腺癌进展为CRPC、如何延长CRPC生存期，是世界范围内的治疗难点。中医药治疗CRPC逐渐成为研究的热点。初步临床研究显示，以蜂*为主要作用成分的蜂针疗法在控制前列腺癌进展方面有一定的作用［2］，初步的实验研究显示，蜂*对前列腺癌细胞具有凋亡诱导作用［3］。本研究拟在前期临床与实验研究的基础上，进一步探究蜂*对PC-3细胞凋亡的影响及其作用机理，为进一步的临床应用提供理论依据，为CRPC的治疗提供思路。一、材料和方法
1.试验药物蜂*注射液，购于长春博奥生化制药有限公司，批号:。2.细胞前列腺癌细胞PC-3购于中山大学实验动物中心细胞实验室。3.试剂MEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶消化液(Gibco公司);四氮甲基唑蓝(MTT，美国Sigma公司)、AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒、Fluo-3AM(南京凯基生物公司)。4.仪器多功能免疫分析仪(PerkinElmer，VIC-TOＲTMX5)，荧光倒置显微镜(Leica，DMI)，流式细胞仪(BeckmanCoulter，FC)。5.方法前列腺癌细胞用含5%FBS的DMEM，均在37℃，5%CO2，饱和湿度恒温培养箱培养，0.25%胰酶消化传代。实验设蜂*注射液不同浓度组和空白对照组。（1）MTT实验：细胞消化后计数，接种至96孔培养板，每孔μl，设4个复孔，细胞贴壁后加入作用药物蜂*注射液，设FD1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，8μg/ml，12μg/ml，16μg/ml，20μg/ml，24μg/ml作用到时间点，后加入5%MTT溶液20μl，继续培养4小时，吸去上清，每孔加入μLDMSO溶液，振荡溶解后酶标仪检测nmOD值。（2）AnnexinV/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡：设FD1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，8μg/ml和空白对照组，细胞接种于6孔板中，细胞贴壁后加入药物处理24小时，收集细胞×g离心5分钟，弃上清，加入μL结合缓冲液，5μLAnnexin-FITC和5μLPI染液，避光孵育15分钟后上机细胞凋亡率。（3）Hoechst凋亡染色：设组和前处理同1.5.2，后加入Hoechest染液，后在倒置显微镜下观察细胞凋亡情况。（4）流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度：细胞接种于6孔板中细胞贴壁后加入药物处理24小时，加入Fluo-3-Am至10μmol/L，置二氧化碳培养箱中孵育30分钟，收集细胞，RCF×g离心，去掉多余的染料。再用D-PBS洗涤2次，后用D-PBS重悬细胞上机检测，检测荧光强度，以此分析Ca2+浓度。6.统计学方法数据以均数±标准差(x±s)表示，用简明统计软件进行分析，检验水平为α=0.05。二、结果
1.MTT实验结果由图1可见，与空白对照组比较，FD1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml组，OD值无明显差异，FD8μg/ml，12μg/ml，16μg/ml，20μg/ml，24μg/ml组OD值均降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。2.流式细胞术检测细胞凋亡由图2可见，与空白对照组比较，FD1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml组，无明显差异，FD8μg/ml作用24小时后细胞凋亡明显增多，差异有统计学意义(P＜0.05)。3.Hoechst由图4可见，与空白对照组比较，FD1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml组无明显变化，FD8μg/ml作用24小时后在荧光显微镜下能见凋亡细胞增多。4.流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度从图5可以看到，在FD4μg/ml，8μg/ml处理后，细胞内Ca2+浓度明显增高，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，尤其以FD8μg/ml组最为显著。三、讨论
蜂针疗法是中医传统疗法，具有抗肿瘤的作用，临床研究显示，蜂针疗法在控制前列腺癌进展方面有明确的作用。蜂*肽是蜂*的主要成分，实验研究证实蜂*肽对前列腺癌细胞具有增殖抑制、凋亡诱导作用［3］。临床与实验研究均证实了蜂*的疗效，鉴于蜂针疗法、蜂*肽临床应用的局限性，我们选取了由蜂*提取制成的已批准的临床药品蜂*注射液进行了上述实验研究，为进一步拓展蜂*的临床应用提供依据。本实验表明，蜂*注射液在8μg/ml以上浓度时，前列腺癌PC-3细胞增殖抑制明显，进一步的流式细胞术及Hoechst染色荧光显微镜观察证实，蜂*注射液在8μg/ml以上浓度，作用24小时后细胞凋亡明显增多，由此证实，蜂*注射液可以诱导前列腺癌细胞凋亡。既往实验已证实p27、p53是蜂*诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡的途径之一［3］。肿瘤细胞凋亡的机理是多方面的。实验测定了前列腺癌细胞内Ca2+浓度，发现4μg/ml，8μg/ml浓度的蜂*注射液可以引起PC-3细胞内Ca2+浓度明显升高。钙离子与细胞凋亡之间关系密切。凋亡的调控由十分复杂的信号网络系统控制，目前已知有三条主要信号通路：线粒体通路、内质网通路、死亡受体通路，大部分与钙离子有关。在钙离子信号与肿瘤细胞凋亡的三条通路中，存在相互促进、互为因果的促凋亡蛋白酶，加速肿瘤细胞凋亡。钙稳态的破坏可以诱导前列腺癌细胞的凋亡［4］，通过升高胞质内的Ca2+浓度，可激活相关凋亡活化因子，可促进前列腺癌细胞的凋亡［5］。由此推测，蜂*注射液可以导致前列腺癌细胞内Ca2+超载，诱导其凋亡。本实验在揭示了蜂*注射液对前列腺癌细胞的凋亡诱导作用及部分可能的机制，为蜂*注射液临床治疗前列腺癌提供了理论依据，为CRPC的治疗提供了思路。蜂*注射液在体内应用是否具有明确的作用，有待进一步的深入研究。-END-
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